Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Entwicklung:

Der amerikanische Wisenschaftler Kary Mullis schrieb das Kapitel der Molekularbiologie neu, als er im April 1983 auf die entscheidende Idee für die PCR während einer nächtlichen Autofahrt auf einer kalifornischen Gebirgsstraße kam. Die Entwicklung und wissenschaftliche Erstpublikation der PCR-Methodik im Jahre 1985 war der Beginn eines außerordentlichen Aufschwungs der Molekularbiologie und brachte ihm 1993 verdientermaßen den Nobelpreis für Chemie ein. Die Bedeutung für die Wissenschaft läßt sich vielleicht darin veranschaulichen, daß sich in der Medline-Datenbank bis dato über 150000 verschiedene Publikationen finden, bei denen die PCR als Schlüsseltechnologie Anwendung gefunden hat.

 

Prinzip:

Wie bei allen genialen Erfindungen ist auch das Konzept der DNA-Amplifikation mittels PCR einfach: Das Prinzip der PCR ist analog zur dem der DNA-Verdopplung in einer lebenden Zelle.

Eine thermostabile, DNA-abhängige DNA-Polymerase synthetisiert in vitro spezifisch neue DNA-Fragmente mit definierter Länge abhängig von einer vorhandenen DNA-Matrize. Der Prototyp dieses DNA-vervielfältigenden Enzyms, die Taq-Polymerase, wurde zunächst aus dem thermophilen Eubakterium Thermus aquaticus isoliert. Mittlerweile wird die Taq-Polymerase hauptsächlich rekombinant hergestellt und ist in verschiedenen Modifikationen für unterschiedlichste PCR-Applikationen kommerziell verfügbar.

Die gesamte PCR basiert auf drei Teilschritten variabler Dauer mit jeweils unterschiedlichen Temperaturen, die ständig wiederholt werden (Zyklen). Im ersten Teilschritt, der Denaturierung der DNA-Doppelstränge, wird die DNA in Einzelstränge aufgeschmolzen (ca. 93-95 °C). Beim zweiten Schritt, dem Annealing (ca. 50-65 °C), lagert sich je eines von zwei synthetisch hergestellten Oligonukleotiden bekannter Sequenz (= Primer) an jeweils einen der beiden (revers komplementären) DNA-Einzelstränge an. Diese Primer flankieren somit den zu amplifizierenden DNA-Bereich. Während des dritten Schritts dienen die hybridisierten Primer der DNA-Polymerase als Startermoleküle (Extension = Polymerisation, ca. 70 °C). In Gegenwart des Enzymsubstrates (Triphosphatnukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und bei geeigneten chemischen Bedingungen entstehen so neu synthetisierte Stränge, die komplementär zum jeweiligen Matrizenstrang durch die DNA-Polymerase verlängert werden. In jedem Zyklus verdoppelt sich dabei die Menge der von den Startmolekülen eingerahmten DNA-Fragmente, die im folgenden Zyklus wiederum als Matrizen dienen.

 

 

Die DNA wird also exponentiell vermehrt, mathematisch betrachtet nach der Formel 2n, wobei n für die Zyklenzahl steht. In der Praxis finden bei einer PCR-Analyse 30 – 40 Zyklenwiederholungen statt. Deshalb lassen sich durch PCR innerhalb weniger Stunden aus winzigen Mengen Matrizen-DNA (z. B. aus Bakterien oder Viren) eine große Anzahl Kopien definierter DNA-Produkte herstellen, die anschließend mit verschiedensten Methoden nachgewiesen und analysiert werden können. Die PCR läuft vollautomatisiert in Geräten ab, die für frei programmierbare, zyklische Temperaturwechsel sorgen und als Thermocycler oder allgemein "PCR-Maschinen" bezeichnet werden. Die PCR-Bedingungen und –Parameter müssen bei jeder PCR-Neuentwicklung empirisch ermittelt und optimiert werden.

 

Detektion:

Aufgrund der negativen Ladungen innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls (dissoziierte Phosphatgruppen im Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA/RNA) wandern Nukleinsäuremoleküle im Gleichstromfeld von der Kathode (Minuspol) zur Anode (Pluspol). Bewegen sich die PCR-Produkte innerhalb einer Gelmatrix im elektrischen Gleichstromfeld, werden sie ihrer Größe nach aufgetrennt (Gelelektrophorese).

 

Diese Eigenschaften werden bei der gelelektrophoretischen Analyse der PCR-Produkte angewendet: Nach Beendigung der PCR wird ein Anteil der PCR (=Aliquot) in Vertiefungen eines Agarosegels aufgetragen, das sich in einer mit geeignetem Puffer gefüllten Pufferkammer befindet. Nach dem Anlegen der Gleichspannung legen die PCR-Produkte innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls je nach ihrer Größe eine definierte Wegstrecke innerhalb des Gels zurück. Um die Größe der PCR-Produkte bestimmen zu können, laufen parallel im Gel DNA-Fragmente bekannter Größe mit (= DNA-Größenmarker). Nach der Gelelektrophorese wird die Lage aller DNA-Banden im Gel durch Anfärbung desselben mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff detektiert. Dieser Farbstoff (meist Ethidiumbromid) lagert sich in die DNA-Doppelhelix flach zwischen die Basenpaare ein (Interkalation) und emittiert unter UV-Beleuchtung eine charakteristische, orangefarbene Fluoreszenzstrahlung. Da das Gel nicht lange haltbar ist, wird ein Gelabbild mittels Videodokumentation elektronisch gespeichert.

Agarosegel mit PCR-Produkten

Je nach Zielsetzung der PCR-Analyse können die PCR-Produkte aus dem Gel buchstäblich mit einem Skalpell ausgeschnitten werden und für weiter Schritte aufgereinigt werden, etwas für Klonierungsexperimente in der Forschung. Für spezielle Fragestellungen ist auch eine direkte DNA-Sequenzanalyse der amplifizierten PCR-Produkte angezeigt.

 

Die hervorstechenden Vorteile der eleganten und universell einsetzbaren PCR-Methode sind ihre Robustheit, Variationsmöglichkeiten, Spezifität und Sensitivität. Auch geringste Spuren von DNA können mit dieser Methode nachgewiesen und diagnostischen Zwecken zugänglich gemacht werden.

 

Neben der oben beschriebenen Standard-PCR werden in der Abteilung Molekularbiologie des Labors Dr. Gärtner & Kollegen vorwiegend nested PCR-Analysen, teilweise –abhängig vom Nachweisobjekt- mit vorgeschalteter reverser Transkription (nested RT-PCR) durchgeführt.