Nested PCR

Die nested PCR (= geschachtelte PCR) ist ein hochsensitives PCR-Verfahren, bei dem zwei PCR-Reaktionen nacheinander geschaltet werden. Ein Anteil (= Aliquot) des PCR-Produktes aus der ersten Amplifikation dient als Matrize für die zweite PCR. In dieser wird durch ein zweites Primerpaar, das an Sequenzbereiche innerhalb dieser Matrize bindet (nested primer), ein kürzeres DNA-Fragment amplifiziert.

Schematischen Darstellung des Nested Primings

Erklärung zur schematischen Darstellung des Nested Primings

  • A: Doppelsträngiges Amplifikat aus der ersten PCR-Amplifikation wird als Matrize in die nested PCR eingesetzt (P1 und P2 sind die komplementären Sequenzen der Primer 1 bzw. 2 aus der ersten Amplifikation).
  • B: Mit den nach innen versetzten Primern Nest 1 und 2 (relativ zu P1 und P2) wird eine zweite Amplifikation (nested PCR) durchgeführt.
  • C: kürzere, hochspezifische, doppelsträngige Amplifikation entsteht.

Ist die zu amplifizierende Ziel-Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure (RNA), wie etwa bei Hepatitis C-Viren, muß vor der (nested-) PCR zunächst eine reverse Transkription geschaltet werden, die RNA in DNA umschreibt.

Der Vorteil der nested-PCR gegenüber der Standard-PCR ist eine um etwa 2 - 3 Zehnerpotenzen gesteigerte Sensitivität gepaart mit gesteigerter Spezifität, da für das nested-PCR-Produkt nur das Produkt der ersten Amplifikation als Matrize dienen kann. Auch geringste Spuren von DNA können mit dieser Methode nachgewiesen und diagnostischen Zwecken zugänglich gemacht werden. Bei optimaler Einstellung einer nested PCR genügen je nach Zielsequenz und -objekt bereits 1 bis wenige Matrizen zur Amplifikation!

Die enorme Sensitivität der nested PCR bedingt allerdings zusätzlich spezielle methodische und arbeitstechnische Maßnahmen sowie bauliche Vorkehrungen im Labor, die in der Abteilung Molekularbiologie des Labors Dr. Gärtner & Kollegen selbstverständlich durchweg erfüllt sind.