Echtzeit-PCR (Real-Time-PCR)

Die Echtzeit-PCR-Technologie ersetzt in zunehmendem Maße die arbeitsaufwendige und kontaminationsanfälligere konventionelle PCR-Analytik mit nachfolgender Agarosegel-Detektion der PCR-Produkte. Ein großer Vorteil dieser Methode ist, daß die PCR-Gefäße nach der PCR-Analyse nicht mehr geöffnet werden müssen, da die Messung nach Beendigung der PCR-Reaktion abgeschlossen ist. Es entfällt somit die Gelelektrophorese der PCR-Produkte, und, was sehr wichtig ist, das Risiko einer Kontamination durch PCR-Produkte, die bei der diagnostischen PCR eine der Hauptkontaminationsquellen darstellt.
Die Echtzeit-PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht und zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung bietet. Dazu müssen parallel zu den (klinischen) Proben eine Kontrolle bekannter Konzentration für eine lineare Regression oder direkt Proben mit definierter DNA-Kopienzahl zur Erstellung einer Standardkurve parallel mitgeführt werden. Die Detektion der Amplifikate wird über Fluoreszenzmessung erreicht.

1. Echtzeit-PCR mit interkalierenden Farbstoffen

Die einfachste (recht ungenaue) Möglichkeit der Quantifizierung von PCR-Produkten ist die Nutzung von DNA-Farbstoffen (z. B. Ethidiumbromid oder SYBR® Green I). Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in der DNA ein (Interkalation) bzw. binden an doppelsträngige DNA, wodurch bei entsprechender Bestrahlung die Fluoreszenz dieser Farbstoffe stark ansteigt. Die Zunahme der Amplifikate-DNA korreliert daher mit einer Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Spezifität, da auch unspezifische PCR-Produkte bzw. Nebenprodukte (Primer-Dimere) diese Farbstoffe einlagern können.
Daher muß nach abgelaufener PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden, anhand derer die Spezifität der Amplifikate bestimmt werden kann. Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA „aufgeschmolzen“, indem bei kontinuierlicher Fluoreszenzmessung die Temperatur im PCR-Gefäß langsam kontinuierlich erhöht wird (z. B. 60 °C bis 95 °C mit einer Heizrate von 0,1 °C/s). Bei einer für das spezifische Amplifikat charakteristischen Schmelztemperatur wird der DNA-Doppelstrang wieder in zwei einzelsträngige Moleküle aufgetrennt. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und somit eine Fluoreszenzabnahme detektiert. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt aufweist als unspezifische Amplifikate, ist eine Unterscheidung möglich. Die Höhe des Schmelzkurven-Peaks gibt –verglichen mit mitgeführten Standards- annähernd Auskunft über die Menge des gebildeten Fragments.
Weisen zwei Amplifikate unterschiedliche Schmelztemperaturen auf, lassen sich mittels Schmelzkurvenanalyse auch Duplex-PCR-Analysen unter Verwendung interkalierender Farbstoffe konstruieren (z. B. PCR-Analyse zum Nachweis des HLA-B27-Allels mit einem ß-Globin-Fragment als interner Amplifikationskontrolle).

2. Echtzeit-PCR mit fluoreszenzfarbstoffmarkierten Sonden

Deutlich spezifischere und genauere Quantifizierungen mit breitem dynamischen Bereich lassen sich unter Ausnutzung von FRET (= Fluoreszenz-/Förster-Resonanz Energie Transfer) vornehmen:
Bei diesem physikalischen Prozeß wird Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffs (Donor-Fluorophor) strahlungsfrei auf einen zweiten, eng benachbarten Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor-Fluorophor) übertragen, der längerwelligeres Licht emittiert. Diese Farbstoffe können kombiniert an eine Sonde (TaqMan-Assay) gekoppelt bzw. separat auf zwei getrennten Sonden lokalisiert sein, die eng benachbart auf der Ziel-DNA hybridisieren (HybProbe-Assay).

2.1 TaqMan-Assay (= 5´-Nuklease-Assay)

Beim TaqMan-Assay wird FRET durch eine doppelt markierte Oligonukleotidsonde (Reporter- und Quencher-Farbstoff) genutzt, die an das Produkt bindet und jeweils einfach mit dem Reporter- bzw. Quencher-Farbstoff markiert sind. Da die beiden Fluoreszenzfarbstoffe an der Oligonukleotidsonde nahe beieinander positioniert sind, wird nach Anregung durch eine Lichtquelle (Argon-Laser, LED oder Halogenlampe) die Energie des Reporter- (Donor-) farbstoffes (R) auf den Quencher- (Akzeptor-) farbstoff (Q) übertragen und nur dieser emittiert Licht (FRET). Während der PCR werden beide Primer mittels der Taq-Polymerase so lange verlängert, bis sie auf die Sonde treffen. Dort wird die Sonde von dem DNA-Strang gelöst und mit Hilfe der 5'-Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase abgebaut. Als Resultat sind beide Fluoreszenzfarbstoffe nicht mehr zusammen positioniert, somit kann kein Energietransfer mehr stattfinden. Beide Fluoreszenzfarbstoffe (R und Q) können jetzt Licht emittieren.
Die Stärke der Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes sollte proportional zur gebildeten DNA-Menge sein. Da diese Reporterfluoreszenz am Ende jedes Extensions-Schritts gemessen werden kann, ohne daß das PCR-Gefäß geöffnet werden muß, kann der Verlauf der PCR-Reaktion direkt verfolgt werden. Innerhalb der PCR-Kurve wird ein geeigneter Punkt für die Quantifizierung gewählt (Ct-Wert = Threshold Cycle = Nummer des Zyklus, bei dem der Schwellenwert für unspezifische Fluoresenzemission überschritten und ein eindeutiges Fluoreszenzsignal detektiert wird). Für eine Quantifizierung kann über parallel mitgemessene Standards mit bekannter DNA-Kopienzahl eine Eichgerade erstellt werden, mittels der die unbekannte DNA-Kopienzahl des jeweils nachgewiesenen Erregers aus der Patientenprobe errechnet werden kann, da der Ct-Wert in direkter Proportionalität mit dem Zehnerlogarithmus der Kopienzahl steht.

2.2 HybProbe-Assay (= LightCycler-Sonden)

Eine weitere Nutzung des FRET zur Detektion bzw. Quantifizierung von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von sequenzspezifischen HybProbes oder LightCycler-Sonden. Zwei verschiedene, jeweils mit einem Donor- bzw. Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotide, die nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe bringen, können als Sonden für die Detektion der PCR-Produkte eingesetzt werden. Identisch zum TaqMan-Assay ist eine Quantifizierung mittels Ct-Werten und internen oder externen Eichgeraden möglich.
Im Gegensatz zum TaqMan-werden die Sonden jedoch nicht zerstört, sondern dissoziieren aufgrund ihrer relativ niedrigen Schmelztemperatur nach jedem Annealing-Schritt vom Amplifikat. Deshalb wird die Fluoreszenzstrahlung auch bereits am Ende jedes Annealing-Schritts gemessen. Nach Beendigung der PCR kann zusätzlich eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden, beispielsweise zur Verifikation der Amplifikate oder gelegentlich als Mittel zu Sensitivitätssteigerung. Die Hauptanwendung liegt aber im eleganten Nachweis von Punktmutationen (z. B Faktor V-Leiden-Mutation F506Q) mittels Schmelzkurvenanalyse (Genotypisierung).
Der Verlauf der Schmelzkurve nach Ablauf der Echtzeit-PCR ermöglicht neben dem Nachweis von Punktmutationen auch die Charakterisierung der Allelsituation (Wildtyp/Heterozygotie/Homozygotie).
Eine der beiden Sonden hybridisiert an dem Teil der Targetsequenz, der dem Wildtyp und der Mutante gemeinsam ist, d. h. dieselbe Sequenz besitzt (Anchor). Die zweite Sonde (Sensor, Detektionssonde) überspannt die Mutationsstelle. Nach dem letzten Zyklus der Echtzeit-PCR und einem kurzen Denaturierungsschritt wird eine Schmelzkurvenanalyse durch langsames Erhöhen der Temperatur, z. B. von 40 °C auf 75 °C (0,1-0,2 °C/s) unter kontinuierlicher Messung der Fluoreszenz durchgeführt, um das Abschmelzverhaltens der HybProbes vom Amplifikat zu erfassen. Bei steigender Temperatur dissoziieren bei einer Detektionssonde mit Wildtypsequenz die weniger stabilen, fehlgepaarten Sonden an den Amplifikaten mit mutierter Sequenz zuerst. Der FRET zwischen beiden Sonden wird unterbrochen, das Fluoreszenzsignal nimmt ab. Die perfekt gepaarten Detektionssonden auf den Wildtyp-Amplifikaten dissoziieren aufgrund ihrer höheren Bindungsenergie etwas später, das Fluoreszenzsignal nimmt erst bei etwas höherer Temperatur ab. Bei heterozygoter Konstellation findet dieser Prozeß nacheinander statt. Natürlich können auch Detektionssonden mit mutierter Sequenz eingesetzt werden, hieraus resultiert ein umgekehrtes Schmelzverhalten im Vergleich zum oben beschriebenen Ablauf.
Bis zu einem gewissen Grad ist dieses Verfahren auch multiplex-fähig, d. h. in mehreren Detektionskanälen können parallel mehrere Mutationen detektiert werden (z. B. die Mutationen C282Y, H63D und S65C im HFE-Gen bei hereditärer Hämochromatose).