DNA-Sequenzanalyse

Als ein Meilenstein trat die Entschlüsselung der Sequenz des menschlichen Genoms in das Blickfeld einer breiten Öffentlichkeit. Diese grandiose Leistung der beteiligten Forschungskonsortien war nur möglich aufgrund einer bis vor wenigen Jahren undenkbaren Steigerung der Rechnerkapazitäten verbunden mit einem rapiden Fortschritt bei der Sequenzqualität und Leseweite und dem Probendurchsatz moderner DNA-Sequenziergeräte. Der Grundstein für die bei diesem Projekt verwendeten Analysemethode (radioaktiv markierte Didesoxy-Kettenabbruchmethode) wurde bereits 1977 durch SANGER und Mitarbeiter gelegt, welche in unten beschriebener modifizierter und weiterentwickelter Form weltweit in Forschungs- und Diagnostikinstituten –selbstverständlich auch im Labor Dr. Gärtner & Kollegen- angewendet wird.

 

Die heutzutage am weitesten verbreitete und flexibleste Methodik der DNA-Sequenzierung besteht aus einer Kombination von linearer (single primer) PCR und der weiterentwickelten Didesoxy-Kettenabbruchmethode mit fluoreszenzfarbstoffmarkierten ddNTPs (dye terminators). Allen Didesoxynukleotiden (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) fehlt jeweils die 3´-OH-Gruppe der Desoxyribose (zusätzlich zur ohnehin fehlenden 2´-OH-Gruppe bei DNA-Molekülen). Bei Einbau der zum Matrizenstrang komplementären ddNTPs ist folglich keine weitere Elongation der neusynthetisierten DNA-Stränge möglich, da die 3´-OH-Gruppe essentiell für die Strangverlängerung durch DNA-Polymerasen ist. An die vier ddNTPs ist zusätzlich jeweils ein unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. In einen Sequenzieransatz wird ein Oligonukleotidprimer eingesetzt, damit die Strangsynthese unidirektional mit einem definierten Startpunkt erfolgt. Vom 3´-OH-Ende des gebundenen Oligonukleotids aus beginnend wird ein zur Matrize (z. B. dem aufgereinigten PCR-Produkt) komplementärer Strang unter Verwendung der vier 2´-Desoxynukleotide (dNTPs) synthetisiert. Parallel dazu erfolgt der Einbau von 2´, 3´-Didesoxynukleotiden (ddNTPs) und damit ein rein statistischer Strangabbruch, da bei den ddNTPs die für die weitere Elongation des neusynthetisierten Stranges nötige 3´-OH-Gruppe fehlt (s. o.). Dadurch entstehen letztlich DNA-Fragmente, deren Längen sich vom Primer ab gerechnet um je eine Base voneinander unterscheiden. Unter Verwendung eines entsprechenden PCR-Programms wird dieser Prozeß zyklisch wiederholt. Die 3´-terminalen Basen der DNA-Fragmente sind bei der Analyse entsprechend durch das Emissionsspektrum der an sie kovalent gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe charakterisiert.

 

Die fluoreszenzfarbstoffmarkierten DNA-Stücke werden nach entsprechender Aufarbeitung anschließend durch ein Harnstoff/Polyacrylamidgel in einem automatischen DNA-Sequenzer ihrer Länge nach aufgetrennt und durch Laserabtastung analysiert. Die Sequenzdaten werden in sog. Elektropherogrammen dargestellt. Neuerdings werden DNA-Sequenzer eingesetzt, bei denen anstatt eines Polyacrylamidgels die Auftrennung der DNA-Fragmente durch (parallel geschaltete) Kapillargelelektrophoresen erfolgt. Diese bedeutende Neuerung ermöglicht deutlich kürzere Analysezeiten bei zusätzlicher Reduktion des Arbeitsaufwandes durch Vermeidung des zeitaufwendigen Gelgießens. Pro DNA-Sequenzierung können auf modernen Geräten parallel 96 Sequenzierungen mit je rund 1000 bp vorgenommen werden.

 

Die resultierenden DNA-Sequenzen werden mit Hilfe lokaler Sequenzdatenbanken auf PCs oder Sequenzdatenbanken internationaler Institutionen via Internet analysiert.

Ausschnitt aus einem Elektropherogramm