Labor Dr. Gärtner: Analytik

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Analytik der in dieser Broschüre beschriebenen medizinischen molekulargenetischen Untersuchungen beruht auf der Amplifikation von Nukleinsäuren in vitro mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einem enzymatischen Verfahren, welches hochspezifisch eine milliardenfache Anreicherung des zu untersuchenden DNA-Abschnittes ermöglicht. Bei dieser hochsensitiven und -spezifischen Methode synthetisiert eine thermostabile DNA-Polymerase neue DNA-Stränge abhängig von einer vorhandenen DNA-Matrize. Die Reaktion wird in einem speziellen Gerät durchgeführt (Thermocycler), welches in der Lage ist, die Temperatur des Reaktionsblocks sehr rasch zu ändern und für jeweils definierte Zeitabschnitte konstant zu halten. Die gesamte PCR basiert auf drei kontinuierlich wiederholten Teilschritten variabler Dauer mit jeweils unterschiedlichen Temperaturen (Zyklen), die als Denaturierung, Annealing und Extension bezeichnet und ca. 30-40mal wiederholt werden. Verschiedene Temperaturen sind notwendig, um die DNA zunächst zu denaturieren (Bildung von Einzelsträngen), daran anschließend die Anlagerung von Oligonukleotiden (= Primer) zu ermöglichen (Annealing) und schließlich die Verlängerung (Extension) der Primer entlang der DNA-Matrize zu einem neuen Tochterstrang zu gewährleisten. Mit jedem neuen Zyklus verdoppelt sich die Menge der von den Oligonukleotiden eingerahmten DNA-Fragmente, die im folgenden Zyklus wiederum als Matrizen dienen. Die DNA wird also exponentiell vermehrt, so daß rechnerisch von einem DNA-Ausgangsmolekül nach 30 Zyklen etwa eine Milliarde Kopien des zu untersuchenden DNA-Sequenzbereichs vorliegen. Bei speziellen Anforderungen an die Analytik werden in einem Reaktionsansatz Fragmente verschiedener Gene oder Genbereiche parallel amplifiziert, wodurch eine simultane Auswertung mehrerer Fragestellungen möglich ist (Multiplex-PCR-Verfahren).

Die hervorstechenden Vorteile der eleganten und universell einsetzbaren PCR-Methode sind ihre Robustheit, Spezifität und Sensitivität. Auch geringste Spuren von DNA können mit dieser Methode nachgewiesen und diagnostischen Zwecken zugänglich gemacht werden. Die enorme Sensitivität der PCR-Technologie erfordert zusätzlich spezielle methodische und arbeitstechnische Maßnahmen sowie bauliche Vorkehrungen im Labor. In der Abteilung Molekularbiologie des Labors Dr. Gärtner & Kollegen sind diese wichtigen Voraussetzungen durchweg erfüllt, so daß Kontaminationen mit DNA-haltigem Material anderer Individuen praktisch ausgeschlossen werden können.

Detaillierte Beschreibungen und Schemata zu den in der Abteilung Molekularbiologie des Labors Dr. Gärtner & Kollegen durchgeführten Methoden sind auf unserer Homepage zu finden (http://www.labor-gaertner.com).

Molekulargenetische Analysen

Zahlreiche genetische Varianten beruhen auf dem Austausch einzelner Basen in nichtcodierenden und codierenden wie auch regulatorischen Bereichen von Genen. Je nach der Häufigkeit des Auftretens in einer Population wird ein Basenaustausch an einer definierten Position im Genom als Einzelnukleotid-Polymorphismus bzw. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) (Allelfrequenz > 1 %) oder Punktmutation (Allelfrequenz < 1 %) definiert. Da der Chromosomensatz des Menschen diploid organisiert ist, also für jedes Gen zwei Allele existieren, können Basenaustausche einfach (heterozygot) oder doppelt (homozygot) im Genom vorliegen. In ihrer phänotypischen Ausprägung kann eine Basensubstitution dominant wirken, d. h. allein ihre heterozygote Präsenz genügt für die Ausprägung des Erscheinungsbilds, oder sich rezessiv verhalten. Letzteres bedeutet, daß sich der Basenaustausch bei heterozygoter Präsenz im Phänotyp nicht bemerkbar macht, beide Allele müssen für die Manifestation des Merkmals diese Variation aufweisen. Als Konsequenz ihrer Verankerung im Genom werden die Basenaustausche nach den Mendelschen Gesetzen der Vererbung weitergegeben. Eine heterozygot präsente Basenvariante wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % auf die Kinder übertragen. Homozygote Merkmalsträger vererben das mutierte Gen generell an die Nachkommenschaft weiter. In diesem Kontext sind auch die Geschwister des Betroffenen einem deutlich erhöhten Risiko ausgesetzt.

Ein im codierenden Bereich eines Gens lokalisierter Basenaustausch hat bei der Umschreibung (Transkription) der in der DNA gespeicherten Information eine entsprechende Veränderung in der Nukleotidsequenz der korrespondierenden Boten-RNA (mRNA) zur Folge. Beim Übersetzen (Translation) dieser mRNA in die von ihr codierte Aminosäurekette kann folglich bedingt durch ein verändertes Basentriplett (Codon) in der mRNA eine falsche Aminosäure in das Protein eingebaut werden. Das veränderte (mutierte) Protein unterscheidet sich in einer Aminosäure gegenüber der Normalform (Wildtyp) mit der Folge einer veränderten Tertiärstruktur, d. h. einer veränderten räumlichen Faltung der Aminosäuresequenz, die die Proteinaktivität positiv oder negativ beeinflussen kann. Im Extremfall hat dies sogar eine Inaktivierung des Proteins zur Konsequenz.

Analytik der amplifizierten DNA

Die Charakterisierung der Allelsituation des jeweiligen Patienten, d. h. die Untersuchung auf die Präsenz einer hetero- oder homozygot vorhandenen Basensubstitution (Punktmutation oder Einzelnukleotid-Polymorphismus) in einem bestimmten Gen, erfolgt häufig alternativ durch zwei der PCR nachgeschaltete Analyseverfahren (RFLP, reverse Hybridisierung). Mit beiden in der Abteilung Molekularbiologie des Labors Dr. Gärtner & Kollegen angewandten Methoden ist eine schnelle und sichere Identifizierung von homo- und heterozygoten Merkmalsträgern gewährleistet.

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

Mit diesem Verfahren erfolgt der Nachweis eines veränderten Schnittmusters der amplifizierten Genfragmente nach einer Behandlung mit speziellen Restriktionsenzymen ("Verdau"), die in der Lage sind, hochspezifisch die Abfolge bestimmter Basensequenzen zu erkennen und den DNA-Doppelstrang an dieser Stelle zu durchtrennen. Durch einen Basenaustausch im Rahmen eines Einzelnukleotid-Polymorphismus oder einer Punktmutation kann es folglich zur Entstehung oder zum Verlust einer Restriktionsschnittstelle kommen, wodurch sich nach der Restriktionsenzymbehandlung die Länge der DNA-Fragmente vom Wildtyp unterscheidet. Diese Fragmente unterschiedlicher Länge lassen sich nach der elektrophoretischen Größenauftrennung in einer Gelmatrix durch Anfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff unter UV-Beleuchtung darstellen.

Reverse Hybridisierung

Die Charakterisierung der amplifizierten und mit Biotin markierten Genfragmente erfolgt durch reverse Hybridisierungen der denaturierten (d. h. einzelsträngigen) PCR-Produkte mit membrangebundenen, sequenzspezifischen Oligonukleotiden. Diese DNA-Hybride können über den Komplex Biotin/Streptavidin-Alkalische Phosphatase mit Hilfe eines chromogenen Substrats farbig auf einem Membranstreifen dargestellt und mittels einer Schablone analysiert werden.

Probenmaterial

Für alle in unserer Abteilung durchgeführten medizinischen molekulargenetischen Untersuchungen wird humane Leukozyten-DNA aus Blut isoliert und zur Analyse herangezogen. Hierfür benötigen wir

generell 4 ml EDTA- (Citrat-, Heparin-) Blut.

Der Versand der Patientenprobe erfolgt bei Raumtemperatur auf dem Postweg oder durch Abholung über unseren Fahrdienst.

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